胰腺癌恶性程度高、发现晚，晚期常伴有高发的肝转移而预后不佳，目前在西方国家肿瘤相关死亡中居第4位［1］。为研究胰腺癌的发病及转移机制、验证新型化疗方案的可行性和有效性，需要进行大量的体内外实验研究或临床试验。其中体内实验应用相关动物模型模拟人类肿瘤环境，从而进行肿瘤相关研究。建立适宜的胰腺癌动物模型，可以为深入研究胰腺癌的发生发展、侵袭转移机制以及寻找新的治疗策略提供有效的手段。小体积的脾内和胰腺内注射法是自发肝转移模型的理想选择，用于研究调控胰腺癌肝转移的机制。胰腺内注射法属于原位移植模型，因肝脏转移瘤形成所需时间长造成荷瘤生存周期长，4 周左右才可形成胰腺原位瘤，培养期间动物的死亡率较高，因而肝转移成瘤率并不高。1984年，Kozlowski 等［2］首次采用脾脏内移植瘤细胞的方法建立肝转移模型，该方法具有培养时间短、转移瘤形成率高、符合血行转移途径的优势，4 周左右即可形成肝脏转移瘤，很快被用于结肠癌和胃癌等消化系统恶性肿瘤的肝转移模型研究。根据已有文献检索，国内目前罕有经脾注射鼠Panc-2 细胞来建立胰腺癌肝转移动物模型的报道，本文尝试建立胰腺癌经脾肝转移动物模型，为胰腺癌肝转移生物学行为的研究以及抗肿瘤药物的筛选提供一个体内实验环境，并对部分转移相关分子的基因表达水平的变化进行初步研究，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物和细胞株 18 只5 周龄，体质量为16～18 g的C57/BL6小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，均置于SPF环境下饲养。鼠胰腺癌Panc-2细胞株（获赠于日本金沢大学Mukaida Naofumi教授）（Panc-2 源自于胰腺癌导管细胞，能在裸鼠上成瘤，属于胰腺低分化腺癌，侵袭力较强，容易制造移植和转移模型）。

1.1.2 主要材料和试剂 RPMI 1640 培养基购自英国Biosera；TRIzol 试剂盒购自美国Invitrogen 公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒购于日本TaKaRa BIO INC；SYBR Premix Ex TaqTM 购于日本TaKaRa BIO INC；PCR 引物购于上海华津生物科技有限公司；美国ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System，等。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 本研究获得复旦大学动物伦理委员会审批，所有实验动物均按照国家卫生研究所的实验室动物福利伦理指南进行。选择处于对数生长期的Panc-2 细胞，以PBS 重悬，配制成瘤细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/mL，锥虫蓝染色证实细胞活力在98%以上。腹腔注射麻醉成功后，小鼠取仰卧位，用0.5%的碘伏消毒。取左上腹纵行切口，长1.0 cm左右，进腹显露脾脏，将其轻轻拖出腹腔外，脾下极进针约1.0 cm，用无齿镊夹持住脾脏下极的中部（注射针尖略向后方），实验组12只小鼠分别缓慢注入瘤细胞悬液50 μL（总计5×105个肿瘤细胞），可见脾包膜迅速鼓起、变白。注射结束，待脾脏颜色转红，快速拔针，迅速用碘伏棉球压迫针眼至少5 min，然后将脾脏送回，全层关腹。采用同样的操作方法，将对照组6 只小鼠注射等量的PBS 缓冲液。术后小鼠常规喂养。待小鼠培养4周时，颈椎脱臼法处死并解剖小鼠，观察脾脏成瘤情况、腹腔内有无肝脏转移以及其他部位转移。取脾脏移植瘤和肝脏转移瘤组织，行苏木精-伊红（H＆E）染色，常规病理学检查。并留取部分脾脏移植瘤体组织、肝脏转移灶及其配对癌旁组织放置于-80℃冰箱保存（癌旁组织，通常是指病变部位旁2 cm 之内的组织区域，结合小鼠肝脏体积较小，本文描述的肝转移灶癌旁组织均取自肝转移灶旁0.5～1 cm之内的肝组织。）。

1.2.2 转移相关因子的基因表达水平检测 首先采用Trizol 法（参考Invitrogen TRIzol 试剂使用说明书）分别提取脾脏移植瘤组织、肝转移瘤组织以及肝转移瘤灶旁肝组织总RNA，再进行反转录PCR（TaKa-Ra PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒），将获得的cDNA 进行qRT-PCR，选用SYBR Premix Ex TaqTM 试剂，按照两步法进行［3-4］。最后使用软件RQ manager 1.2.1 进行数据分析，得出相关分子的基因在不同组织中的表达fold change值，进行统计学分析。

1.3 统计学方法

用GraphPad Prism 5.0 及SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示，样本间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型构建

实验组1只小鼠在第4周死亡，尸检发现该小鼠出现肝脏转移伴腹膜多发转移，余11只小鼠活力减弱，遂终止实验。实验组12只小鼠中10只出现肝脏转移瘤，总体的肝脏成瘤率为83.33%，解剖发现：12只小鼠腹腔内均见有较多的血性腹水，脾脏均于注射部位出现单一的种植瘤结节；其中10只肝脏表面及切面见有大小不等的灰黄色病灶，弥散分布，部分融合成块；此外，除死亡的1只小鼠腹腔内见多发灰白色小结节，余11只小鼠均未见明显腹膜结节形成。肝脏病灶行病理学检查，镜下见部分组织呈实性片状生长，少数有腺管形成，细胞体积大，核大、深染，异型明显，可见小核仁，核分裂相多见，间质少，体积较大的病灶中央多可见片状坏死钙化灶，坏死区内可见细胞肿胀，细胞核染色质絮状或边集、细胞膜及细胞器膜溶解破裂、细胞自溶等细胞坏死现象，符合胰腺导管腺癌的特征。上述实验结果表明小鼠胰腺癌经脾肝转移模型成功建立。对照组小鼠活动如常，解剖后观察脾脏和肝脏红润，均未见结节形成（图1）。